Home
Wprowadzenie
Programy
Inne
  

Izolacja bakterii, organizmów grzybopodobnych i grzybów

Słownik niezrozumiałych pojęć tutaj

Sporządzenie trafnej diagnozy fitopatologicznej najczęściej wymaga wyodrębnienia sprawcy choroby i jego wyhodowania w jednogatunkowej kulturze. W celu wyeliminowania zmienności wewnątrzgatunkowej wskazane jest otrzymać kulturę rozpatrywanego sprawcy z jednego zarodnika. Kulturę jednozarodnikową można otrzymać przez:

1.
Przeniesienie końcem igły preparacyjnej możliwie małego fragmentu zarodnikującej struktury mikroorganizmu do kropli sterylnej wody umieszczonej w centrum szalki Petriego wypełnionej pożywką agarową.
2.
Rozmazanie kropli z zarodnikami po powierzchni pożywki w wyniku energicznego przemieszczania szalki ruchem kolistym po płaskiej powierzchni, np. po stole.
3.
Wycięcie końcem igły preparacyjnej pojedynczego, kiełkującego zarodnika wraz z niewielką ilością pożywki i zainokulowanie nim czystego podłoża.

Jednogatunkowe kultury pasożytów obligatoryjnych, grzybów mikoryzowych i niektórych organizmów grzybopodobnych oraz grzybów glebowych nie dających się hodować na sztucznych podłożach mikrobiologicznych otrzymuje się wskutek inokulowania ich roślin gospodarzy jednostkami infekcyjnymi tych mikroorganizmów.

Izolowanie bakterii. Bakterie porażonych organów roślin izoluje się przez:

1.
Aseptyczne wycięcie fragmentu porażonej tkanki wraz z przyległą tkanką zdrową.
2.
Umieszczenie wyciętego fragmentu rośliny w probówce zawierającej sterylną wodę i jego zmacerowanie wskutek zgniatania, np. końcem szklanej bagietki. Celem maceracji jest umożliwienie wydostania się komórek bakterii ze zmiażdżonych tkanek.
3.
Zainokulowanie podłoża agarowego przez zygzakowate rozprowadzenie zawiesiny bakterii końcem szklanej bagietki lub ezą, albo przez jej rozlanie.
4.
Sukcesywne przeszczepianie pojawiających się kolonii bakteryjnych na czyste podłoża w celu otrzymania kultur jednogatunkowych.

 
Góra: pogranicze między tkanką zdrową i zainfekowaną; dół: maceracja wycinka z tkanką zdrową i chorą w wodzie przy użyciu bagietki
Od lewej: kolonie bakterii wyrosłe na podłożu agarowym po jego zainokulowaniu zawiesiną bakterii rozprowadzoną zygzakowato (1, 2) i przez jej rozlanie (3, 4)

Izolowanie fakultatywnych pasożytów grzybopodobnych i grzybowych. Sposób izolowania fakultatywnych pasożytów zależy od ich miejsca występowania.

Organizmy grzybopodobne i grzyby z porażonych części roślin izoluje się przez:

1.
Umieszczenie porażonych organów w wilgotnych komorach, tj. na przykład w szalce Petriego z położoną na dnie wilgotną bibułą lub gazą. Wyrastające po kilku dniach inkubacji organizmy grzybopodobne lub grzyby identyfikuje się bezpośrednio lub organizmy te są przenoszone na powierzchnię odpowiedniej pożywki agarowej i dalej hodowane w celu określenia dodatkowych cech diagnostycznych.
2.
Wyłożenie fragmentów porażonej tkanki na pożywkę agarową i stopniowe przeszczepianie ukazujących się kultur organizmów grzybopodobnych lub grzybów na czyste podłoża w celu uzyskania kultur jednogatunkowych. Fragmenty chorującej rośliny powinny pochodzić z pogranicza tkanki zdrowej i porażonej. Aby wyeliminować mikroorganizmy powierzchniowe, wyodrębnione fragmenty przed ich położeniem na pożywkę agarową powinny być powierzchniowo zdezynfekowane, np. przez zanurzenie w wodnym roztworze podchlorynu sodu (NaOCl) o 1% koncentracji sodu przez 10 min. Wyeliminowanie z kultur organizmów grzybopodobnych i grzybowych bakterii umożliwia używanie pożywek z antybiotykiem, np. ze streptomycyną lub terramycyną w koncentracji 100 µg l-1.
3.
Wyłożenie powierzchniowo zdezynfekowanych nasion na bibułę wilgotnej komory lub pożywkę agarową. Inne zalecenia są identyczne jak te przedstawione wyżej.
4.
Zakładanie pułapek glebowych. Pułapkami glebowymi są kawałki mięsistych organów roślin zakopane w glebie na okres 2-7 dni. Następnie pułapki te przenosi się do wilgotnych komór lub dzieli się na fragmenty, którymi inokuluje się pożywki agarowe w celu zidentyfikowana patogena. Najczęściej stosowanymi pułapkami są kawałki:
  • owocu awokado zasiedlane przez Phytophthora cinnamomi,
  • owocu jabłoni zasiedlane przez Phytophthora spp.,
  • marchwi zasiedlane przez Thielaviopsis basicola.

 
Inicjowanie zarodnikowania organizmów grzybopodobnych i grzybów przez inkubowanie organów roślin w wilgotnych komorach
Inicjowanie zarodnikowania organizmów grzybopodobnych i grzybów przez inkubowanie organów roślin w w kulturach agarowych
Inicjowanie zarodnikowania organizmów grzybopodobnych i grzybów przez inkubowanie nasion w kulturach agarowych naświetlanych światłem fluorescencyjnym

Izolowanie obligatoryjnych organizmów grzybopodobnych i grzybów pasożytniczych. Jednogatunkowe kultury obligatoryjnych patogenów grzybopodobnych i grzybowych organów nadziemnych rośliny uzyskuje się w wyniku:

1.
Wyodrębnienia zarodników obligatoryjnych pasożytów z porażonej rośliny.
2.
Zainokulowania zdrowej, wrażliwej rośliny gospodarza wyizolowanymi zarodnikami.
3.
Inkubowania zainokulowanych roślin w warunkach sprzyjających infekcji i zarodnikowaniu patogena.

Obligatoryjne patogeny grzybopodobne i grzybowe organów podziemnych rośliny izoluje się przez:

1.
Założenie kultur pułapkowych z wrażliwymi roślinami gospodarzami patogena. Kultury pułapkowe tworzy się z mieszaniny ziemi i znajdujących się w niej korzeni porażonych roślin. Mieszaninę tę można zmieszać z gruboziarnistym piaskiem w stosunku 1:1-2 w celu zwiększenia jej przepuszczalności i właściwego napowietrzenia. Po wypełnieniu wazonów podłoże obsiewa się dużą liczbą nasion w celu efektywnego wyłapania patogena gęsto rosnącymi korzeniami.
2.
Wyodrębnienie nowo uformowanych zarodników patogena albo bezpośrednio z gleby (np. zarodników przetrwalnikowych wskutek mokrego przesiania zawiesiny wodnej gleby przez sita glebowe, metody omówionej niżej), albo z powierzchni korzeni wcześniej wypłukanych z używanego podłoża.

Izolowanie arbuskularnych grzybów mikoryzowych. Arbuskularne grzyby mikoryzowe (AGM) są obligatoryjnymi symbiontami tworzącymi zarodniki w strefie korzeni roślin gospodarzy. Grzybów tych nie można hodować na sztucznych podłożach. Dlatego ich zarodniki wyodrębnia się metodą mokrego przesiewania przez zestaw sit glebowych. W celu ułatwienia wyodrębnienia zarodników tych grzybów, zwykle obecne zanieczyszczenia mineralne i organiczne oddziela się przez ich odwirowanie.

Szczegółowy sposób postępowania przy izolowaniu zarodników AGM jest następujący:

1.
Przenieś 100 g suchej gleby do naczynia zawierającego 1000 ml wody. Gdy gleba jest zbrylona, umieść tę mieszaninę w lodówce na co najmniej 12 h (krok 1., vide niżej)).
2.
Używając bagietki wymieszaj energicznie i dokładnie otrzymaną mieszaninę przez 30 s.
3.
Po 10-sekundowej przerwie przelej łagodnie zawiesinę przez zestaw sit glebowych, pozostawiając osad znajdujący się na dnie naczynia. Zestaw ten powinien zawierać sita o wymiarach oczek 0,8 (sito górne), 0,1 i 0,04 mm. Sito górne służy do wyodrębnienia sporokarpów i zatrzymania resztek organicznych. Osad tego sita należy spłukać do szalki Petriego i sprawdzić obecność sporokarpów używając mikroskopu stereoskopowego (krok 2.).
4.
Spłukać osad z najniższego sita do szalki Petriego o śr. 10 cm (krok 3.). W przypadku gleby zawierającej małą ilość materii organicznej (np. gleba wydmowa), zarodniki AGM można wyizolować bezpośrednio za pomocą zakraplacza lub pipety zaopatrzonej w gumową ssawkę. Izolowanie zarodników znacznie ułatwia dodanie do zawiesiny sacharozy [ok. 20-25 g (2-2,5 łyżeczki do herbaty) do ok. 40 ml zawiesiny], która powoduje ich wypłynięcie na powierzchnię. Następnie zarodniki te można łatwo pobrać używając nieco spłaszczonej igły preparacyjnej. Zarodniki zbiera się zarówno zakraplaczem lub pipetą, jak i igłą preparacyjną wykorzystując mikroskop stereoskopowy (krok 4.). Gdy badana gleba zawiera dużo materii organicznej, metodą znacznie ułatwiającą zobaczenie zarodników jest wirowanie zawiesiny pochodzącej z najniższego sita w roztworze sacharozy. Czynność tę wykonuje się w sposób opisany w pkt. 5-13.
5.
Przenieś zawiesinę wodną gleby i zarodników AGM do dwóch pojemników dostępnej wirówki.
6.
Doprowadź zawartość obu pojemników do jednakowej objętości przez dodanie wody.
7.
Włóż pojemniki do przeciwległych stanowisk adaptera wirówki i zamknij jej wieko.
8.
Wiruj mieszaninę przez 5 min z prędkością 1600 obr. min-1.
9.
Ostrożnie zlej wodę znajdującą się nad mieszaniną gleby i zarodników skondensowaną w dolnej części pojemników.
10.
Dodaj do każdego pojemnika jednakową ilość 50% wagowo-objętościowego roztworu sacharozy. Roztwór ten sporządź przez rozpuszczenie 500 g sacharozy w 400 ml wody, po czym uzupełnij wodą jego objętość do 1000 ml. Nie wykorzystany roztwór sacharozy przechowuj w lodówce.
11.
Wiruj ponownie mieszaninę przez 1 min z prędkością 1600 obr. min-1.
12.
Zawartość pojemników znajdującą się nad osadem skupionym na ich dnie szybko przelej przez sito o średnicy oczek 0,04 mm.
13.
Materiał zatrzymany na sicie dokładnie przepłucz wolnym strumieniem wody w celu wypłukania sacharozy i przelej go do szalki Petriego. Poza zarodnikami AGM materiał ten zwykle zawiera jeszcze niewielką ilość części organicznych, nicienie i sklerocja.
14.
Wyodrębnij zarodniki AGM jednym ze sposobów omówionych w pkt. 4.

 
Izolowanie arbuskularnych grzybów mikoryzowych z gromady Glomeromycota (objaśnienia vide wyżej)

Metodę izolowania AGM przedstawioną wyżej można również użyć do wyodrębniania innych grzybów glebowych lub struktur przez nie tworzonych, np. zygospor przedstawicieli rzędu Endogonales i sklerocjów.